Gen klonlama tək bir genin kopyası və ya klon edilməsi hərəkətidir. Gen müəyyən edildikdən sonra klon biyomedikal və sənaye araşdırmalarının bir çox sahələrində istifadə edilə bilər. Genetik mühəndislik genlərin yeni orqanizmlərə klonlanması və ya protein məhsulunu dəyişdirmək üçün DNT sekansını dəyişdirmə prosesidir. Genetik mühəndislik aşağıdakı əsas prosedurları yerinə yetirmək qabiliyyətindən asılıdır.
01 Polimeraz zəncirinin reaksiyası
02 Məhdudlaşdırma fermentləri
Məhdudlaşdırma endonükleazları kimi tanınan fermentlərin aşkar edilməsi zülal mühəndisliyi üçün zəruridir. Bu fermentlər nükleotid ardıcıllığına əsaslanaraq müəyyən yerlərdə DNT-ni kəsdi. Fərqli bir yerdə DNT kəsmə qabiliyyətinə malik olan yüzlərlə müxtəlif məhdudiyyətli fermentlər müxtəlif bakteriyaların müxtəlif növlərindən təcrid olunmuşdur. DNT məhdudlaşdırma fermenti ilə kəsilən müxtəlif ölçülü kiçik parçalardan ibarətdir. Bunlar jel elektroforez və ya kromatoqrafiya istifadə edərək ayrılır.
03 Elektroforez
Bir hüceyrə mədəniyyətindən təmizləyici DNA və ya məhdudlaşdırma enzimi ilə kəsmək DNT-i görməmiş olsaydıq, yəni ekstraktı bir şey ehtiva etdiyini və ya olmadığını yoxlamaq üçün bir yol taparsanız, onu kəsdi. Bunu etmək üçün bir yol jel elektroforezdir. Gels müxtəlif DNT əlamətləri və knockouts aşkar etmək üçün kəsilmiş DNA keçirmək üçün müxtəlif məqsədlər üçün istifadə olunur.
04 DNT-nin iki hissəsinə qoşulun
Genetik tədqiqatda, tez-tez DNT-nin iki və ya daha çox fərdi ipliklərini birləşdirmək, rekombinant iplik yaratmaq və ya məhdudlaşdırma fermentləri ilə kəsilmiş bir dairəvi iplik bağlamaq lazımdır. DNT ligazları adlanan fermentlər nükleotid zəncirləri arasında kovalent əlaqələr yarada bilər. Bu prosesdə, boşluqları doldurmaq və ya 5 'uçlarını fosforilataşdırmaq üçün, fermentlər DNT polimeraz I və polinükleotid kinaz da vacibdir.
05 Kiçik Özünü Çoğalayan DNT Seçimi
Bakterial genomun bir hissəsi olmayan, lakin özünü təkrar edə bilən kiçik dairəvi DNT parçaları plazmidlərdir. Plazmidlər mikroorqanizmlər arasında genlərin nəqli üçün tez-tez vektorlar kimi istifadə olunur. Biotexnologiyada, maraq geni gücləndirildikdən sonra həm gen, həm də plazmid məhdudlaşdırma fermentləri ilə kəsilir, onlar birlikdə rekombinant DNT kimi tanınanların yaranmasını birləşdirirlər. Viral (bakteriyofaj) DNT də kosmiklər, bakteriyofag genləri olan rekombinant plazmidlər kimi bir vektor kimi istifadə edilə bilər.
06 Bir Vektorun bir Host hücresine keçməsi üsulu
Bir plazmid kimi bir vektorda genetik maddəni yeni konakçı hüceyrələrə köçürmə prosesi transformasiya adlanır. Bu texnika ev sahibi hüceyrələrin ətraf mühit dəyişikliyinə məruz qalmasını tələb edir ki, bu da onları "səlahiyyətli" və ya vektor üçün müvəqqəti olaraq keçir. Elektroporasiya belə bir texnikadır. Plazmid nə qədər böyükdürsə, onun hüceyrələr tərəfindən qəbul etdiyi məhsuldarlıq aşağı olur. Daha böyük DNT seqmentləri transdüksiya adlanan bir metodda bakteriyofag, retrovirus və ya digər viral vektor və ya kosmiklər vasitəsilə daha asan klonlanır. Phage və ya viral vektor rejenerativ tibbdə tez-tez istifadə edilir, lakin biz istəmədiyimiz, komplikasiyalara və hətta xərçəngə səbəb olan xromosomların bəzi hissələrində DNT-nin yerləşdirilməsinə səbəb ola bilər.
Transgenik orqanizmləri seçmək üsulları
Dönüşüm əsnasında bütün hüceyrələr DNT etməyəcək. Bunu edənlərin aşkarlanması üçün bir üsul olması vacibdir. Ümumiyyətlə, plazmidlər antibiotik müqaviməti üçün genlər daşıyırlar və transgenik hüceyrələr həmin genlərin ifadəsinə və antibiotikdən ibarət olan media üzərində böyüməyə imkanları əsasında seçilə bilərlər. Alternativ seçmə metodları x-gal / lacZ sistemi kimi digər müxbir zülalların və ya rəng və floresansa əsaslanan seçimə imkan verən yaşıl floresan proteininin varlığından asılıdır.