DNT-nin sıralanması və genləri gücləndirməsi ilə PCR hansıdır
Polimeraz zənciri reaksiyası ( PCR ) bir genin bir neçə nüsxəsini hazırlamaq üçün molekulyar bir genetik üsuldur və ayrıca gen sıralaması prosesinin bir hissəsidir.
Polimeraz zəncirinin reaksiyası necə işləyir?
Genin nüsxələri bir DNA nümunəsi ilə hazırlanır və texnologiya nümunədə tapılan genin bir nüsxəsindən bir neçə nüsxə çıxarmaq üçün kifayətdir. Milyondan çox nüsxə çıxarmaq üçün bir genin PCR amplifikasiyası, DNA parçasının ölçüsü və yükünə (+ və ya) əsaslanan görmə metodlarını istifadə edərək gen sekanslarının aşkarlanmasına və müəyyən edilməsinə imkan verir.
Nəzarət şəraitində DNT-nin kiçik seqmentləri "şablon" kimi tanınan bir DNA parçasına pulsuz dekoxinükleotidlər (dNTPs) əlavə edən DNT polimerazları kimi tanınan fermentlər tərəfindən yaranır. Polimeraz üçün başlanğıc nöqtəsi olaraq "primerlər" adlanan daha kiçik DNT parçaları istifadə olunur. Astarlar, DNT (oligomerlər) adətən, 15 ildən 30 nükleotid uzunluğunda kiçik yapışdırılmış parçalardır. Onlar gücləndirilmiş genin çox sonunda qısa DNT sequence bilmək və ya tahmin tərəfindən edilir. PCR zamanı DNT-nin sıralanması qızdırılıb və ikiqat iplər ayrılır. Soyuduqdan sonra, primerler şablon (bağırlama adlandırılır) və polimerazın başlanması üçün bir yer yaradır.
PCR Texnikası
Polimeraz zənciri reaksiyası (PCR) termofil və termofil polimeraz fermentlərinin (yüksək temperaturda istilikdən sonra struktur bütövlüyü və funksionallığı qoruyan fermentlər) aşkar edilməsi ilə mümkün olmuşdur.
PCR üsulunda iştirak edən addımlar aşağıdakılardır:
- DNT şablonun, polimeraz enziminin, primerlərin və dNTPlərin optimallaşdırılmış konsentrasiyaları ilə qarışıq yaradılır. Fermenti denatürsüz qarışığı qızdırmaq qabiliyyəti 94 dərəcə Selsi səviyyəsində DNT nümunəsinin cüt sarmalının denatürlənməsinə imkan verir.
- Denaturasyonun ardından, nümunə, 54 dərəcə ətrafında daha mötədil bir aralığa qədər soyudulur və primerlərin tək strandlı DNT şablonlarına tavlanması asanlaşdırır.
- Döngünün üçüncü mərhələsində nümunə uzanma üçün Taq DNT Polimeraz üçün ideal temperaturda 72 dərəcəyə qədər isidilir. Uzatma zamanı, DNT polimeraz, hər primerin 3 'ucuna tamamlayıcı dNTPlər əlavə etmək və maraq geninin bölgəsində iki tərəfli DNT bir hissəsini meydana gətirmək üçün DNT-nin orijinal tək strandını bir şablon kimi istifadə edir.
- Dəqiqə uyğun olmayan DNK sekanslarına tavlı olan primerlər 72 dərəcə tavlanır və beləliklə, maraq geninə uzanır.
Bu denaturing, tavlama və uzanma prosesi çoxlu (30-40) dəfə təkrarlanır, beləliklə qarışıqda istənilən genin nüsxələrinin sayını artırır. Bu proses manuel olaraq həyata keçirilsə də olduqca yorucu olmasına baxmayaraq nümunələr hazırlana və proqramlaşdırılabilən bir Thermosyclerdə inkübləşdirilə bilər, indi ən çox molekulyar laboratoriyalarda adi bir vəziyyətdədir və tam bir PCR reaksiyası 3-4 saatda həyata keçirilə bilər.
Hər bir denatürmə mərhələsi əvvəlki dövrünün uzanma prosesini dayandırır, beləliklə yeni DNT-lərini kəsərək istənilən genin təxminən ölçüsünə qədər saxlayır.
Uzatma dövrünün müddəti, faiz geninə uyğun olaraq daha uzun və ya daha qısa müddətdə edilə bilər, lakin nəticədə, təkrarlanan PCR dövrü sayəsində, şablonların əksəriyyəti yalnız maraq geninin ölçüsü ilə məhdudlaşacaqdır hər iki primerin məhsullarından yaranacaqdır.
Nəticələri yaxşılaşdırmaq üçün manipulyasiya edilə bilən müvəffəqiyyətli PCR üçün bir neçə fərqli amildir . PCR məhsulunun mövcudluğunu test etmək üçün ən çox istifadə olunan üsul agaroz jel elektroforezidir . DNT-lərin ölçüsünə və yükünə görə ayırmaq üçün istifadə olunur. Fraqmentlər daha sonra boyalar və ya radioizotoplar istifadə edərək görüntülenir.
Evolution
PCR aşkar edildikdən sonra orijinal Taqdan başqa DNT polimerazları aşkar edilmişdir. Bunlardan bəziləri daha yaxşı "proofreading" qabiliyyətinə malikdir və ya daha yüksək temperaturda daha sabitdir, beləliklə PCR spesifikliyini yaxşılaşdırır və yanlış dNTP'nin yerləşdirilməsindən səhvləri azaldır.
PCR-nin bəzi dəyişiklikləri xüsusi proqramlar üçün nəzərdə tutulmuşdur və hazırda molekulyar genetik laboratoriyalarda mütəmadi olaraq istifadə olunur. Bunlardan bəziləri Real-Time PCR və Reverse-Transcriptase PCR'dir. PCR kəşfi də DNT sequencing, DNA barmaq izi və digər molekulyar texnika inkişafına gətirib çıxardı.