Polimeraz zəncirinin reaksiyasının (PCR) reaksiyasının hər hansı bir hissəsinə düzəlişlər məhsulun məhsuldarlığı və keyfiyyətini yaxşılaşdırmaq və ya azaltmaqla və ya reaksiya spesifikliyini və həssaslığını artırmaqla nəticənin keyfiyyətini dəyişdirə bilər. Nəticədə təsir göstərən parametrlər fiziki (məsələn, temperatur, dövr dövrü) və ya kimyəvi ola bilər (yəni şablon konsentrasiyası, istifadə edilən enzim tipi). Aşağıdakılar PCR'nin müvəffəqiyyətinə təsir edən bir neçə əsas amildir.
01 Təmiz laboratoriya şərtləri
PCR tək molekullu DNA molekulunu aşkarlaya bildiyinə görə, laboratuvarda pristine şərtlərin qorunması vacibdir. Həmişə təzə əlcək geyin, steril şüşə qablardan, borulardan və pipet tövsiyələrindən və steril həllərdən istifadə edin və iş yerini işə başlamadan əvvəl təmizləyin.
Həmişə düzgün nümunənin amplifikasiyası ilə nəticələnməsini təmin etmək üçün şəffaf DNT olmadan və fermentsiz nəzarət reaksiyalarını daxil edin.
Çoxu problemlərin həllini asanlaşdırmaq üçün birgə istifadə olunmayan və təyin edilmiş boruların yalnız PCR üçün birbaşa kənara çıxarılmasını təmin edən öz həll yollarına malik olduğundan əmin olun. DNase və RNase-free PCR boruları, aerosol davamlı pipet tipləri və UV çıraqlı bir duman başlığında çalışan problemlər də problemləri minimuma endirir.
02 Kimyəvi komponentlər
- 18-dən 24-ü bazalar var
- Təkamül strukturuna malik olmur (yəni, saç tirnoqları)
- G / C və A / T cütlərinin balanslaşdırılmış paylanması
- 3-ayaq uçlarında bir-birinə tamamlayıcı olmur
- Erkən temperatur (Tm) təxminən 5-10 dərəcə Celcius temperaturun aşağı temperaturun altında, ümumi olaraq 55 ilə 65 dərəcə Celcius
Hər iki primer üçün Tm ən yaxşı nəticələrə görə də eyni olmalıdır.
03 Reaksiya Mix: Şablon və Astarlar
Optimal primer konsentrasiyaları 0,1 ilə 0,6 mikromol / L arasındadır. Şablon miqdarı DNT (insan, bakterial, plazmid) növündən asılı olaraq dəyişir.
Çox şablon miqdarı ilə, artan dövrü sayları və ya isti başlanğıcın istifadəsi kimi nəticələrin yaxşılaşdırılması üçün digər strategiyalar var. Həmişə yeni primerləri müsbət idarəetmə reaksiyası ilə sınayın, onlar sizin xüsusi eksperimental şərtlərinizlə işləyəcəklər.
04 Reaksiya Mix: Enzim Aktivliyi
Reaksiya qarışığındaki MgCl2 konsentrasiyası PCR nəticəsinə təsir göstərə bilər və daha qətiyyətli reaksiyalarda əhəmiyyətli rol oynaya bilər. Maqnezium katyonu, polimeraz enzimin qəbul etdiyi əsl substratı istehsal etmək üçün dNTP ilə həll olunan komplekslər meydana gətirir.
Bütün dörd dNTP-nin bərabər miqdarı da polimeraz səhv dərəcəsini azaltmağa kömək edir. Beta, BSA, deterjan, DMSO, gliserol və pirofosfataz kimi müəyyən hissələr də ferment spesifikliyinə və reaksiya effektinə təsir göstərə bilər.
05 Termosikl tipi
Laboratoriya avadanlıqları üçün alış-veriş edərkən, bəzi termosikllər dəqiq, istənilən temperaturların saxlanılmasında başqalarından daha az dəqiq olduğunu unutmayın.
Bu, ucuzlaşdığınız bir sahə uzun müddət qısa müddətli bir reaksiya ilə qarşılaşdıqda və ya dar bir temperatur temperaturu tələb edən primerlərdən istifadə edərkən ödəməyəcək.
İstifadə etdiyiniz dəqiq marka termosiklinə uyğun olaraq hazırlanmış nazik divarlı reaksiya boruları da reaksiya temperaturlarını optimallaşdırmağa kömək edir.
06 Cycle Ayarları
Artırılmış verim, daha az şəffaflığın artırılması üçün daha az fermenti kompensasiya etmək üçün hər 20 dövr üzrə uzadma müddətini artırmaqla əldə edilə bilər. Ümumiyyətlə, az 40 dövr etidyum bromid boyalı agaroz geli izləmək üçün kifayət qədər böyük bir konsentrasiyaya 10 şablondan az molekülü artırmaq üçün kifayətdir.