DNT sequencing də bir baz çifti qədər kiçik ölçüsü ilə fərqli olan DNA strands ayırmaq üçün jel elektroforez istifadə etmək qabiliyyətinə bağlıdır.
DNT sıralaması
1970-ci illərin sonlarında, daha uzun DNT molekulları üçün iki DNT sequencing üsulu icad edilmişdir. Bunlar Sanger (ya da dideoxy) metodu və Maxam-Gilbert (kimyəvi parçalanma) metodu idi. Maxam-Gilbert metodu kimyəvi maddələr tərəfindən nükleotidlərə xüsusi bölünməyə əsaslanır və ən yaxşı oligonükleotidlərin (uzunluğu 50 bazadan az olan az nükleotid polimerləri) ardıcıl olaraq istifadə etmək üçün istifadə olunur. Sanger üsulu daha tez-tez istifadə olunur, çünki tətbiq olunması texniki cəhətdən daha asandır və PCR- nin inkişafı və texnika avtomatlaşdırılması ilə birlikdə, bütün genləri də daxil olmaqla, DNA-nın uzun şeritlərinə asanlıqla tətbiq olunur. Bu üsul PCR uzadılması reaksiyaları zamanı dideoksinükleotidlər tərəfindən zəncirləmə dayandırılmasına əsaslanır.
Sanger metodu
Sanger üsulunda analiz ediləcək DNT şeridi bir şablon kimi istifadə edilir və DNT polimeraz, primerlərdən istifadə edərək, komponentlərdən istifadə etmək üçün PCR reaksiyasında istifadə olunur.
Dörd müxtəlif PCR reaksiya qarışığı hazırlanır, hər biri dörd nükleotidin (ATP, CTP, GTP və ya TTP) birinə dideoxynucleoside trifosfat (ddNTP) analoglarının müəyyən bir faizini ehtiva edir. Yeni DNT şeridin sintezi, bu analoglardan birinə daxil oluncaya qədər davam edir, bu zaman qapaq əvvəlcədən kəsilir.
Hər bir PCR reaksiyası, bu reaksiya üçün etiketli dideoksi olan nükleotid ilə bitən, müxtəlif uzunluqlu DNT zəncirlərindən ibarət qarışığı ehtiva edir. Jel elektroforez dörd ayrı zolaqda dörd reaksiyanın ipliklərini ayırmaq üçün istifadə edilir və nüelotid ilə hansı ipliklərin uzunluğuna əsaslanan orijinal şablonun sırasını müəyyənləşdirir.
Avtomatlaşdırılmış Sanger reaksiyasında, dörd fərqli rəngli floresan etiket ilə etiketlənmiş primerlər istifadə olunur. Fərqli dideoksi nükleotidlərin iştirakı ilə PCR reaksiyaları yuxarıda göstərildiyi kimi aparılır. Bununla yanaşı, dörd reaksiya qarışıqları bir araya toplanır və bir jel zolağına tətbiq olunur. Hər bir parçanın rəngləri lazer işarəsi ilə müəyyən edilir və məlumat hər bir rəng üçün zirvələri göstərən, şablon DNT sekansının təyin oluna bilən kromatogramları yaradan bir kompüter tərəfindən toplanır.
Tipik olaraq, avtomatlaşdırılmış sıralama metodu maksimum uzunluğu təxminən 700-800 əsas cütlüyə qədər ardıcıllıqlar üçün dəqiqdir. Lakin, primer Walking və Shotgun sequencing kimi step-wise üsulları istifadə edərək, daha böyük genlərin və əslində bütün genomların tam ardıcıllığını əldə etmək mümkündür.
Primer Walking'da daha geniş bir genin işlənə bilən bir hissəsi Sanger üsulu ilə sıralanır. Yeni primerler dizinin etibarlı bir seqmentindən yaranır və orijinal reaksiyaların aralığından kənara çıxan genin hissəsini sıralamağa davam edir.
Shotgun sequencing , maraqların DNT seqmentini təsadüfi olaraq hər bir fragmanı sıralamaq və üst-üstə düşən ardıcıllıqlara əsaslanaraq tərtib etmək üçün daha uyğun (idarəolunan) ölçülü fraqmentlərə çevirir. Bu üsul, üst-üstə düşən parçaları təşkil etmək üçün kompüter proqramının tətbiqi ilə asanlaşdırılıb.