Protein saflığının dərəcəsi proteinin nəzərdə tutulan son istifadəindən asılıdır.
Bəzi tətbiqlər üçün xam ekstraktı kifayətdir. Bununla belə, qidalar və dərman preparatları kimi digər məqsədlər üçün yüksək səviyyədə təmizliyə ehtiyac vardır. Bu bir neçə zülal təmizləyici üsula nail olmaq üçün bir sıra təmizlənmə addımlarında istifadə olunur.
Hər bir zülal təmizləyici adətən bir sıra məhsul zərərinə səbəb olur. Buna görə ideal zülal təmizləyici bir strategiya, ən az təmizlənmə səviyyəsinə ən azı addımlarda çatdığı bir yerdir. Istifadə olunan addımların seçimi hədəf proteinün ölçüsünə, yüklənməsinə, çözünürlüğüne və digər xüsusiyyətlərinə bağlıdır. Aşağıdakı üsullar bir sitosol proteinini təmizləmək üçün ən uyğundur. Sitozolik protein komplekslərinin təmizlənməsi daha mürəkkəbdir və adətən müxtəlif üsulların tətbiq olunmasını tələb edir.
Protein təmizlənməsi üçün ilk addımlar
Hüceyrə içərisində ( hüceyrə içərisində) zülalların təmizlənməsində ilk addım xam ekstraktın hazırlanmasıdır.
Ekstraktı hüceyrənin sitoplazmasından bütün proteinlərin və bir sıra əlavə makromoleküllərin, kofaktorlar və qida maddələrindən ibarət olan kompleks qarışığı ehtiva edir. Xam ekstraksiya biotexnologiyada bəzi tətbiqlər üçün istifadə edilə bilər, lakin təmizliyi bir məsələdirsə, sonrakı saflaşdırma addımlarına riayət edilməlidir.
Xam protein çıxarışları kimyəvi liflər və fermentlər , sonikasiya və ya Fransız mətbuatı ilə əldə edilən hüceyrə lilizasiyasında meydana çıxan hüceyrə dağıntılarının aradan qaldırılması ilə hazırlanır. Çöküntülər santrifüqasiya ilə silinir və supernatant bərpa olunur. Ekstrasellüler zülalların xam preparatları santrifüqləşmə ilə hüceyrələri sadəcə çıxararaq əldə edilə bilər.
Bəzi biotexnologiya tətbiqləri üçün termostabil fermentlərə tələbat var: Yüksək temperaturlara denatür olmadan tolerantlıq verə bilən fermentlər və yüksək spesifik aktivliyin qorunması. Onları istehsal edən orqanizmlər bəzən ekstremofillər deyilir. İstiliyədavamlı bir zülalın təmizlənməsi üçün asan bir yanaşma qarışıqdakı digər zülalları isitmə yolu ilə denatlaşdırmaq, sonra həllini soyutma (zəruri hallarda termostabil fermentin islah edilməsinə və ya yenidən həll edilməsinə imkan verəcəkdir). Sonra denatüre edilmiş proteinlər santrifüqasiya ilə aradan qaldırıla bilər.
Aralıq təmizlənmə addımları
Keçmişdə bir xam ekstraktı bir zülal təmizləmək üçün ortaq bir ikinci addım yüksək osmotik gücü (yəni duz həlləri) olan bir həlldə yağış idi. Xam ekstraktdakı nuklein turşuları streptomisin sulfat və ya protamin sulfat ilə yaranan aqreqatların çökməsi ilə aradan qaldırıla bilər.
Protein yağıntısı ümumiyyətlə duz kimi ammonium sulfat istifadə edilir.
Müxtəlif zülallar ammonium sulfatın müxtəlif konsentrasiyalarında çökəcək . Ümumiyyətlə, yüksək molekulyar çəki zülalları ammonium sulfatın aşağı konsentrasiyalarında çökür. Tuz yağışı, adətən, çox təmiz bir proteinə yol açmır, lakin bir qarışıqda bəzi istenmeyen zülalların aradan qaldırılmasında və nümunənin konsentrasiyasına kömək edə bilər. Solüsyonlar, daha sonra gözenekli selüloz borusu, filtrasyon ya da gel dışlama kromatografisi yoluyla diyaliz yoluyla giderilir.
Müasir biotexnologiya protokolları tez-tez standart proseduralar üçün hazır həllər təqdim edən bir çox ticari mövcud kitten faydalanır. Protein təmizlənməsi tez-tez filtrlər və hazırlanmış qel filtrasiya sütunları ilə həyata keçirilir. Bütün etməlisiniz təlimatlara əməl edin və hüququ həlli hüququ həcmini əlavə edin və süzgəni toplayarkən (sütunun digər ucundan çıxan) yeni bir test borusundakı müəyyən müddətə gözləyin.
- Kromatoqrafik metodlar tezgah üst sütunları və ya avtomatik HPLC avadanlıqları ilə tətbiq oluna bilər. HPLC ilə ayrılması tərs faza, ion dəyişdirmə və ya ölçmə istisna üsulları və diod array və ya lazer texnologiyası ilə müəyyən edilmiş nümunələrlə həyata keçirilə bilər. مور
Protein görünüşü və təmizlənmənin qiymətləndirilməsi
- Ters fazlı xromatoqrafiya (RPC) onların nisbi hidrofobikliklərinə əsaslanan zülalları ayırır. Bu texnika yüksək seçicidir, lakin üzvi həlledicilərin istifadəsini tələb edir. Bəzi zülallar solventlər tərəfindən daimi olaraq denatüre edilir və RPC zamanı funksiyanı itirəcəkdir. Buna görə bu metod, bütün hədəflər üçün tövsiyə edilmir, xüsusilə də hədəf proteinin aktivliyini qoruya bilməsi lazımdır.
- İon-mübadilə kromatoqrafiyası zülallara əsaslanan zülalların ayrılmasına aiddir. Sütunlar ya anion mübadiləsi və ya kation mübadiləsi üçün hazırlana bilər. Anion mübadiləsi sütunlarında mənfi yüklü zülalları cəlb edən pozitiv itkisi olan stasionar faz var. Katyon mübadiləsi sütunları, müsbət yüklü zülalları cəlb edən əks, mənfi yüklü boncuklardır. Hedef protein (ler) nin elüsyonu, sütunun pH'ını dəyişdirərək, hər proteinin şarjlı funksional qruplarının bir dəyişiklik və ya nötralizasyonuna səbəb olur.
- Kiçik moleküllər xromatoqrafiya sütununda çapraz bağlı polimerdən daha sürətli hərəkət etdiyindən ölçülü həddindən artıq xromatoqrafiya ( jel filtrasiya ) kiçik proteinlərdən böyük proteinlər ayırır. Böyük zülallar polimerin gözeneklerine sığmırlar, kiçik proteinlər isə xromatoqrafiya sütunundan daha az gediş yolu ilə səyahət etmək üçün daha uzun sürürlər. Eluate, elüsyon müddətinə əsaslanan zülalları ayırd edən bir sıra borularda toplanır. Selülit filtrasiyası, hədəf protein əvvəlcədən sütuna əlavə olunduğundan daha kiçik bir elüsyon həcmində toplandığından bir protein nümunəsinin konsentrasiyası üçün faydalı bir vasitədir. Bəzi filtrasiya üsulları onların böyüklüyündən zərif məhsul istehsalında istifadə edilə bilər.
- Affinity kromatoqrafiyası proteinlərin təmizlənməsi prosesini "yaxalamaq" və ya tamamlamaq üçün çox faydalı bir üsuldur. Xromatoqrafiya sütununda boncuklar hədəf proteinə xüsusi olaraq bağlanan ligandlarla əlaqələndirilir. Protein sərbəst ligandları olan bir həll ilə yuyulması ilə sütundan çıxarılır. Bu metod, digər üsullarla müqayisədə ən təmiz nəticələr və ən yüksək spesifik aktivlik verir.
- SDS-PAGE poliakrilamid jel elektroforezdir, onlara SDS (sodyum dodesil sulfat) iştirakı ilə verilir ki, bu da onlara böyük bir xalis mənfi yük verən zülallara bənzəyir. Bütün zülalların ittihamları ədalətlə bərabər olduğundan, bu üsul onları demək olar ki, tamamilə ölçüsünə görə ayırır. SDS-PAGE tez-tez bir sıra hər addımdan sonra protein təmizliyini test etmək üçün istifadə olunur. İstenmeyen zülallar qarışıqdan tədricən çıxarılırsa, istənilən proteini təmsil edən yalnız bir bant var qədər SDS-PAGE jelində görüntülenen bantların sayı azalır.
- İmmünoblotinq , afinite kromatoqrafiyası ilə birlikdə tətbiq olunan bir zülal görmə üsuludur. Belirli bir protein üçün antikorlar bir afinite kromatografi kolonunda ligandlar olaraq istifadə olunur. Hədəf protein sütunda saxlanılır, sonra sütunu duz həllinə və ya digər maddələrə batıraraq çıxarılır. Radioaktiv və ya boya yazıları ilə əlaqəli antikorlar hədəf zülalın aşkarlanmasına kömək edir və qarışığın qalan hissəsindən ayrılır.
Mənbələr:
Zubay G. 1988. Biokimya, 2-ci nəşr. Macmillan Publishing Co, New York, NY, ABŞ.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Arıtma Elmi Kitab, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc, Nyu-Cersi, ABŞ. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.